凱杰Qiagen DNA提取試劑盒說明書以QIAamp DNA FFPE Tissue Kit為例來進(jìn)行說明。

一、實驗試劑的準(zhǔn)備

步驟一：配置QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒緩沖液

檢查Buffer ATL及Buffer AL原液是否有沉淀物形成。有沉淀形成時，須升溫至70℃同時適度晃動，使沉淀物全部溶解。

步驟二：配置Buffer AW1

在19ml Buffer AW1原液中加入25ml(96-100%)無shui酒精，蓋緊瓶蓋并搖勻。在試劑瓶上作已加入無shui酒精的標(biāo)記，同時須標(biāo)注配置時間。配置好的溶液可在室溫(15-20℃)下保存一年。

步驟三：配置Buffer AW2

在13ml Buffer AW2原液中加入30ml(96-100%)無shui酒精，蓋緊瓶蓋并搖勻。在試劑瓶上作已加入無shui酒精的標(biāo)記，同時須標(biāo)注配置時間。配置好的溶液可在室溫(15-20℃)下保存一年。

二、操作步驟

1. 使用刻刀修整石蠟組織上組織周圍多余的石蠟。

2. 根據(jù)組織大小不同切取10μm厚的石蠟組織切片4~10張。如石蠟標(biāo)本組織面暴露于空氣中時間過長，須舍棄前2~3張石蠟組織切片。

3. 將切取的石蠟組織切片置入已做好標(biāo)記的1.5ml eppendorf tube中，加入1ml二甲苯。蓋緊蓋子并使用vortex振蕩器充分振蕩10s。

4. 使用Thermo離心機在全速狀態(tài)下離心2min。實驗全程須保持在室溫狀態(tài)下進(jìn)行(15~25°C)。

5. 離心結(jié)束后，使用移液器吸取并遺棄上部已溶解石蠟的二甲苯溶液，操作中應(yīng)注意不要將下方的組織也同時丟棄。

6. 加入1ml 96％~100%無shui酒精，再次vortex振蕩器充分振蕩。目的是用酒精充分溶解組織中殘留的二甲苯。

7. 在室溫下全速離心2min。

8. 使用移液器吸取并遺棄上部已溶解二甲苯的酒精溶液，操作中應(yīng)使用細(xì)小的移液器頭并應(yīng)注意不要移去下方蕩洗后的組織。

9. 在室溫下打開eppendorf tube蓋子，靜置至所有殘余酒精全部揮發(fā)。

10. 加入180μl buffer ATL及20μl蛋白酶K，vortex振蕩器充分振蕩。

11. 封口膜封閉已加入試劑的eppendorf tube，分別將其插入浮漂并置于預(yù)先已升溫至56°C的水浴鍋中。孵育至少一小時或過夜，至組織wanquan裂解完畢。

12. 預(yù)先加熱另一側(cè)水浴鍋至90°C，將56°C水浴鍋中組織已wanquan裂解的樣本置于90°C水浴鍋中，孵育1h。注意應(yīng)嚴(yán)格控制溫度以及孵育時間，過高的溫度以及過長的時間可能損害最終所提取DNA的完整。過短時間和較低溫度則可能造成福爾馬林解鉸聯(lián)不che di，DNA提取總量降低。

13. 1h后將標(biāo)本取出并低速離心，將eppendorf tube蓋子以及側(cè)壁的液體甩入瓶中。待標(biāo)本冷卻至室溫時，加入2μl RNase A，用以去除溶液中殘存的RNA。

14. 在每個樣本中加入200μl buffer AL以及200μl無shui酒精，并立即vortex振蕩充分混勻，形成均一的組織溶液。同時也可產(chǎn)生部分白色不溶沉淀，但不影響后期DNA提取。

15. 再次低速離心，將eppendorf tube蓋子以及側(cè)壁的液體甩入瓶中。

16. 將包裝內(nèi)的QIAamp MinElute column取出并按照標(biāo)本次序做好對應(yīng)的標(biāo)記。仔細(xì)的將eppendorf tube中全部懸液移至QIAamp MinElute column中，操作過程中需注意要將所有液體全部轉(zhuǎn)入吸附柱中，勿浸濕吸附柱與收集管邊緣或遺留部分懸液。6000×g (8000 rpm)離心2min，之后將下方收集管中的濾過液以及收集管一并遺棄。從離心機中取出QIAamp MinElute column動作要小心，操作過程中注意防止下方濾過液回流。如果離心2min后仍有部分溶液存在于上方過濾柱內(nèi)，須采用更高的離心速度以及更長的離心時間再次離心直至過濾柱中wanquan排空。

17. 將離心完畢的吸附柱置于新的收集管中，小心打開盛放樣品的吸附柱蓋子，分別加入500μl AW1，注意加入洗液時勿浸濕吸附柱與收集管邊緣。蓋好蓋子后6000×g (8000 rpm)離心1min，離心完畢后將下方收集管中的濾過液以及收集管一并遺棄。操作過程中注意防止下方濾過液回流。如果離心1min后仍有部分溶液存在于上方過濾柱內(nèi)，須采用更高的離心速度以及更長的離心時間再次離心直至過濾柱中wanquan排空。

18. 將離心完畢的吸附柱置于新的收集管中，小心打開盛放樣品的吸附柱蓋子，分別加入500μl AW2，注意加入洗液時勿浸濕吸附柱與收集管邊緣。蓋好蓋子后6000×g (8000 rpm)離心1min，離心完畢后將下方收集管中的濾過液以及收集管一并遺棄。操作過程中注意防止下方濾過液回流。如果離心1min后仍有部分溶液存在于上方過濾柱內(nèi)，須采用更高的離心速度以及更長的離心時間再次離心直至過濾柱中wanquan排空。

19. 將離心機調(diào)至最高轉(zhuǎn)速至少(20,000×g; 14,000 rpm)，離心3min，甩盡吸附柱內(nèi)殘存的酒精。

20. 重新準(zhǔn)備已消毒的對應(yīng)標(biāo)記好的1.5ml eppendorf tube，將離心完畢的吸附柱放置于離心管中，并丟棄下方的廢液收集管。注意整個過程保持動作平穩(wěn)，防止下方濾過液回流污染吸附柱。小心打開吸附柱蓋子，加入15μl buffer ATE。操作時應(yīng)注意將ATE直接滴加至吸附膜中央，同時應(yīng)保證ATE為室溫以保證其溶解效率。最終洗脫體積將少于總加入ATE總量約5μl。

21. 蓋好瓶蓋并靜置至少5min，之后將離心機調(diào)至最高轉(zhuǎn)速至少(20,000 ×g; 14,000 rpm)，離心1min。

22. 將離心得到的DNA溶液應(yīng)用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及濃度。

23. 將檢測合格的DNA保存于-20°C冰箱。