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Elabscience一步法TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒是一款靈敏度高且能快速簡便的檢測細胞凋亡的產(chǎn)品。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟切片、冰凍切片)和細胞樣本(細胞涂片、細胞爬片)的原位凋亡檢測，檢測結(jié)果可通過熒光顯微鏡直接觀察。那么你知道Elabscience一步法TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒該怎么用嗎？讓我們一起來看看吧！
一、試劑配制
1) 1×蛋白酶K工作液：取1μL Proteinase K (100×) 加入99μLPBS中，混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
2) 1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 將DNase I Buffer (10×) 稀釋待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
3) DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作液，按照 99：1 稀釋比將 DNase I (20 U/μL) 稀釋待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
注：DNase I 會在劇烈混合下變性，建議不要渦旋
DNase I 溶液。
4) DAPI工作液：取4μLDAPI Reagent(25μg/mL)加入96μL PBS中混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
二、固定與通透
1. 細胞樣本
1) 細胞爬片：將細胞爬片浸入PBS漂洗1次，濾紙吸干周圍水分，再浸入固定液（自備），室溫固定 15~20 min 或4°C固定1~2 h。
細胞涂片：收集細胞，加入一定體積的 PBS 重懸細胞沉淀，然后加入和PBS等體積的固定液（自備），室溫固定15~20 min 或 4°C固定1~2 h。600×g 離心 5 min，PBS重懸，取25~50μL細胞懸液涂片在載玻片上晾干。
注：細胞固定是分析凋亡樣本的重要步驟。未固定的細胞可能會丟失較小的 DNA片段，導(dǎo)致較低的信號。
2) 固定好的樣本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3) 將樣本浸入通透液（自備）中，37°C 作用 10 min。
4) 將通透好的樣本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
2. 石蠟切片
1) 用常規(guī)方法將切片脫蠟水化。將切片浸入二甲苯（自備）脫蠟2次，每次10 min；無水乙醇（自備）浸泡切片2次，每次5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自備）各一次，每次 3 min。
注：低溫可能影響二甲苯脫蠟效果。當(dāng)室溫低于 20°C 時，二甲苯脫蠟時間可延長至 20 min。
2) 脫蠟好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
3) 濾紙吸干切片組織周圍的水分，每個樣本上滴加100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反應(yīng) 20 min。
注：不同組織或物種的樣本反應(yīng)時間可能不同。建議進行預(yù)實驗，確定反應(yīng)時間。
4) 將通透好的樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5min。
3. 冰凍切片
1) 取出冰凍切片，平衡至室溫，再浸入固定液（自備），室溫（15~25°C）固定 30 min。
2) 固定好的樣本浸入 PBS 漂洗2次，每次5 min。
3) 每個樣本上滴加100 μL 1×蛋白酶K工作液，37°C 反應(yīng)10~20 min。
注：不同組織或物種的樣本反應(yīng)時間可能不同。建議進行預(yù)實驗，確定反應(yīng)時間。
4) 將通透好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
三、標(biāo)記
1. 分組設(shè)置
分組 | 樣本選擇 | 特點 | 目的 |
陽性對照 | 任選一張實驗組切片 | 可選做，DNase I處理切斷 DNA，產(chǎn)生暴露的 3'-OH末端，作為陽性樣本 | 驗證實驗流程和試劑的有效性 |
陰性對照 | 任選一張實驗組切片 | 可選做，標(biāo)記工作液中不含 TdT酶 | 排除樣本自發(fā)熒光及樣本和染色試劑的非特異性染色；調(diào)整曝光強度 |
實驗組 | 待檢測切片樣本 | 必做，孵育標(biāo)記工作液，保持實驗檢測條件的一致性 | 實驗數(shù)據(jù)來源 |
陽性對照
1) 滴加100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的樣本上, 室溫平衡5 min。
2) 用吸水紙去除樣本上多余的液體。加入100 μL稀釋后的DNase I工作液（200 U/mL)，37°C孵育10~30 min。
3) 樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
陰性對照
1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的樣本上，室溫平衡 5 min。
2) DNase I Buffer孵育陰性樣本，37°C 孵育10~30 min。
3) 樣本浸入PBS漂洗3次，每次 5 min。
實驗組
1）實驗組通透完成后在PBS中靜置，等待陽性對照和陰性
對照處理后共同進行標(biāo)記染色。
2. 標(biāo)記工作液的配制
計算好樣本量集中配置，每個樣本用量按照下表配制，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。
組分 | 陽性對照/實驗組 | 陰性對照 |
TdT Equilibration Buffer | 35 μL | 40 μL |
Labeling Solution | 10 μL | 10 μL |
TdT Enzyme | 5 μL | 0 μL |
3. 標(biāo)記步驟
1) 每個樣本滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，37°C 濕盒中平衡 10~30 min。
2) 吸水紙吸除TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每個樣本滴加50 μL標(biāo)記工作液，放入濕盒中37°C避光反應(yīng)60 min。
注：如果信號強度較弱，則可延長 DNA 標(biāo)記反應(yīng)的培養(yǎng)時間。某些系統(tǒng)可能需要在37°C下反應(yīng)4小時。
3) 樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
4) 吸水紙吸干水分后滴加DAPI工作液，室溫避光孵育5min，對細胞核進行復(fù)染。
5) 樣本浸入PBS漂洗4次，每次 5 min。
6) 用吸水紙吸干多余的液體，用含抗熒光淬滅劑（自備）的封片劑封片。
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